兩點一線 探尋細胞生命的“年輕因子”

在對生命本源的幻想中，人們總是前往隱秘之處尋找“不老泉”，而事實上，生命不老的秘密或許在它最小的單位中——

3月26日，我國科學家首次鑒定出使衰老間充質干細胞重獲活力的“年輕因子”——多梳蛋白4（CBX4），并對其功能進行了驗證，相關研究成果發布于《細胞報道》上。

幾天后的4月1日，《公共科學圖書館·生物學》發表了同一科學家團隊的另一個全新發現，首次在人間充質干細胞中確立了“年輕通路”——YAP-FOXD1，并證明該通路的激活可減輕細胞衰老及骨關節炎。

如果說前者是科學家團隊在干細胞中發現了“不老泉眼”，那么后者的研究則是“兩點一線”地確定了細胞生命的“青春之河”。

“該研究揭示了YAP-FOXD1通路在人干細胞去衰老及骨關節炎基因治療中的作用與分子機制。”論文通訊作者之一、中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，研究由中科院生物物理所劉光慧研究組同北京大學湯富酬研究組、中科院動物所曲靜研究組合作完成，研究團隊歷經五年的努力從縱橫交織的細胞基因調控網絡中，證明了YAP-FOXD1通路的存在，并通過細胞和動物水平的實驗證明了它的功能。

為癌基因“正名” YAP蛋白充當“年輕因子”

YAP-FOXD1通路中最先撞入科學家視野的是YAP蛋白。網上搜索YAP蛋白的“簡歷”，可以發現，與它關系最密切的是一條被業內稱為“河馬通路”的Hippo信號通路。

“河馬通路”的上游一旦接收到抑制生長的信號，經過一系列激酶磷酸化反應后，最終以磷酸化的形式作用于下游效應因子YAP蛋白，決定YAP蛋白的磷酸化與否。

如果不被磷酸化，沒有磷酸化基團“尾巴”的拖累，YAP便能夠輕易進入細胞核，進入基因調控的大本營。這時YAP扮演的是“傳令官”，它在大本營里的出現引來基因的活躍，它會選擇與自己的靶基因結合，“傳令下去”，催促靶基因表達出相應的RNA和蛋白質，從而影響細胞的生命活動。

“我們首先找到了YAP，它是一個功能明確的轉錄輔助激活因子。”劉光慧說，在細胞核里YAP可以和它的轉錄因子“伙伴”TEAD結合，共同激活下游靶基因的轉錄。

YAP如果帶上了磷酸化基團的“尾巴”，就會被阻滯留在細胞質中，YAP無法到細胞核中“傳令”，下游基因的轉錄表達受到抑制，細胞增殖也會受到抑制。

有報道指出，如果YAP進行頻繁“傳令”、不受節制，將會讓細胞無限制增殖，進而可能引發腫瘤，因此被認為是一種“癌基因”。

YAP的特性給了研究團隊兩個任務：一是從功能上證明，它的存在與否是否與細胞的“年輕態”相關；二是它如何把“命令”傳遞下去進而調控功能基因的功能呢？它的“接令員”是誰，之前有沒有被其他科學家找到呢？

為回答第一個問題，團隊從正反兩個角度進行驗證。“我們通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，發現了一系列可以延緩人類間充質干細胞衰老的蛋白。這些蛋白敲除后細胞會出現加速衰老的表型。”論文第一作者、中國科學院生物物理研究所博士生付麗娜說，基因敲除的工作開始于人胚胎干細胞，通過導入3種不同質粒，研究團隊讓人干細胞基因組中負責編碼YAP蛋白的那段基因發生缺失。

“敲除的基因組DNA大概是幾千個堿基，雖然敲除幾個堿基也可能使得YAP因子失去功能，但是很可能導致新的異常蛋白的產生，從而引入無法排除的因素。”付麗娜說。團隊必須確保YAP基因的完全沉默。為此，他們對CRISPR/Cas9基因編輯技術進行了改良，使其能夠對巨大的YAP基因位點進行較大片段的刪除。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，團隊獲得了YAP特異性敲除的人胚胎干細胞，通過定向分化技術，將人胚胎干細胞定向誘導分化為間充質干細胞。“YAP缺失的人間充質干細胞表現出嚴重的加速衰老表型。”劉光慧說，YAP在維持人成體干細胞年輕態中發揮著關鍵作用，雖然YAP在某些腫瘤細胞中被證明具有“癌基因”的功能，但在人間充質細胞中卻扮演著“年輕因子”的角色。

全新的“兩點一線” 找到YAP蛋白“鐵桿伙伴”和“接令員”

YAP通過與轉錄因子TEAD的相互作用來啟動下游基因的轉錄，也就是說TEAD和YAP是“鐵桿伙伴”。此前研究發現，YAP和TEAD通過YAP的N末端和TEAD的C末端間相互作用形成蛋白復合物，該蛋白復合物在YAP介導的細胞增殖中發揮著關鍵性的作用。

團隊的第二個任務是尋找YAP的“接令員”。“我們假設YAP的某個或某些靶基因介導了人間充質干細胞年輕態的調節。”劉光慧說，“通過系列實驗，我們發現YAP可以轉錄激活FOXD1，這是一個新型的YAP靶基因，之前從未被報道過。”

叉頭框（FOX）蛋白家族包含50多個轉錄因子，在胚胎發育、細胞周期調控、糖類和脂類代謝、衰老調節等多種生物學過程中發揮作用。FOXD1是其中一個轉錄因子。付麗娜解釋，之前有報道指出FOXD1能調節器官發育，并具有促進細胞增殖和細胞重編程的活性。

“我們首先對YAP敲除的人間充質干細胞進行了RNA測序，進一步結合轉錄因子結合元件的預測，我們推斷FOXD1可能是YAP的一個新型靶基因。”付麗娜說，隨后，為了驗證推斷，團隊利用染色質免疫沉淀（ChIP）方法“釣”出能夠特異性地結合FOXD1啟動子DNA的蛋白（即YAP），最終證明是FOXD1從YAP處接過“命令”，開啟調節細胞“年輕化”的分子程序。

“YAP是上游，FOXD1是下游。它們是一對命運共同體。”劉光慧解釋，隨著細胞衰老，YAP和FOXD1的表達都發生了一致性下調。

或助力基因治療 未來可有效干預衰老相關疾病

從干細胞出發，發現機制機理，再回到細胞、生命體驗證，“青春之河”的發現必須在生物體中證明自己的“魔力”。

“我們在三種細胞衰老模型中證明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用，YAP或FOXD1的過表達能使衰老的人間充質干細胞重新獲得增殖能力。”付麗娜說。另一方面，細胞實驗的結果提示了過表達YAP或FOXD1可能使衰老的動物間充質組織（如關節）變得更加年輕。

團隊接下來在動物身上實施了基因治療。“我們在小鼠體內證明了YAP或FOXD1蛋白的過表達作為骨關節炎基因治療方案的可行性和有效性。”劉光慧說，團隊以慢病毒載體為基因導入媒介，將編碼YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨關節炎的小鼠的關節腔內。數周的YAP或FOXD1基因治療均可顯著降低關節軟骨中衰老細胞的比例，有效抑制關節軟骨退化及關節腔炎癥，從多個方面改善骨關節炎的病理表型。

骨關節炎是典型的與細胞衰老關系密切的人類疾病。這些研究結果均證明，通過基因導入干細胞“年輕因子”，有望在未來治療以骨關節炎為代表的衰老相關疾病。找對“不老泉眼”或者“青春之河”，將為基因治療提供明確的標靶，最終對衰老相關疾病的干預提供有效的解決方案，并進行臨床應用。（張佳星）